biokimia lanjutan alias biola

menyangkut masalah tugas2 kuliah...hha..

mengenang waktu kuliah meski masih berusaha utk lulus 2013 ini..

mencoba membantu bagi yg menginginkan ...:)

dan sekedar pengetahuan saja...

NAMA : SABAT OKTA CERIA S

NIM : 08091003027

 

DETEKSI CEPAT BAKTERI Escherichia coli DALAM SAMPEL AIR DENGAN METODE POLYMERASE CHAIN REACTION MENGGUNAKAN PRIMER 16E1 DAN 16E2

Penelitian ini dilakukan untuk mendeteksi Escherichia coli dalam berbagai sampel air dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan primer 16E1 dan 16E2.

Adapun metode kerjanya yakni Sampel dikumpulkan dari sepuluh sumur di daerah pemukiman padat penduduk di bantaran Kali Ciliwung di kawasan Bukit Duri, Jakarta. Kontrol positif dalam penelitian adalah Escherichia coli ATCC 25922 dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Kontrol negative adalah Salmonella typhi dari Laboratorium Mikrobiologi Departemen Farmasi FMIPA-UI.

Isolasi DNA menggunakan Cethyltrimethyl ammonium bromide/CTAB. Isolat bakteri Escherichia coli ATCC 25922 yang telah dikultur dalam medium Nutrient Broth selama 18-24 jam pada suhu 37 ^oC dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifus 1,5 mL steril dan disentrifus pada suhu 20 ^oC 3 menit dengan kecepatan 10.000 × g. Supernatan dibuang, kemudian pelet sel yang diperoleh disuspensikan kembali dalam 557 μl dapar STET (sukrosa, basa Tris, EDTA, Triton). Sebanyak 10 μl larutan lisozim 10 mg/mL, 30 μl SDS 10%, dan 4 μl proteinase-K ditambahkan ke dalam suspensi tersebut. Suspensi dihomogenkan kemudian diinkubasi pada suhu 37 ^oC, 60 menit. Sebanyak 65 μl NaCl 4M dan 80 μl CTAB dan diinkubasi pada suhu 65^oC, 30-60 menit. Selanjutnya diekstraksi dengan 650 μl kloroform dan 26 μl isoamilalkohol (24:1, v/v) dan disentrifus pada suhu 20^oC, 20 menit dengan kecepatan 10.000 × g. Bagian supernatan diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifus 1,5 mL yang baru dan steril. Ekstraksi dengan kloroform dan isoamilalkohol dilakukan sebanyak dua kali setelah itu supernatant ditambahkan 400 μl isopropanol dingin. Larutan tersebut disentrifus pada suhu 20 ^oC, 3 menit dengan kecepatan 10.000 × g. Pelet DNA yang diperoleh ditambahkan etanol 70% dingin sebanyak 1 ml dan dikocok dengan perlahan. Selanjutnya, disentrifus pada suhu 20 ^oC selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 × g. Supernatan dibuang dan pelet DNA dikeringudarakan. Setelah kering, pelet DNA direhidrasi dalam 40 μl air MilliQ (ddH2O) dan diinkubasi pada suhu 37 ^oC selama 15 menit sampai melarut sempurna, kemudian disimpan pada suhu 4 ^oC.

Penyiapan Template DNA dari Sampel Air dengan Metode Boiling. Template DNA disiapkan menurut cara Medici, et al. Sampel air diambil sekitar 200 mL dan ditampung dalam vial 250 mL dan segera disimpan di lemari pendingin. Sebanyak 100 mL sampel disentrifus dengan kecepatan 10.000 × g selama 10 menit pada suhu 4 ^oC. Pelet disuspensikan dalam 2 mL Nutrient Broth dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 18-24 jam. Sebanyak 1 mL sampel dalam media Nutrient Broth dipindahkan ke tabung mikrosentrifus 1,5 mL dan disentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 14.000 × g. Supernatan dibuang dengan hati-hati. Pelet diresuspensi dengan 300 μL MilliQ dan disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 14.000 × g. Pelet diresuspensi dengan 300 μL MilliQ kemudian diinkubasi selama 15 menit pada suhu 100^oC dan segera dimasukkan ke es. Setelah itu tabung disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 14.000 × g pada suhu 4 ^oC. Supernatan dipindahkan secara hati-hati ke tabung mikrosentrifus yang baru, diinkubasi kembali selama 10 menit pada suhu 100 ^oC dan segera dimasukkan ke dalam es. Supernatan disimpan pada suhu -20 ^oC.

Amplifikasi Template DNA dengan PCR. Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan PCR Master Mix (Fermentas) sesuai dengan prosedur yang dianjurkan oleh Fermentas. Ke dalam tabung mikrosentrifus 0,5 mL dimasukkan 25 μl PCR mixture yang terdiri dari 25 μl PCR Master Mix (0,05 U/mL Taq DNA polymerase; 0,4 mM masing-masing dNTP; 4 mM MgCl₂), 2 μL Primer 16E1, 2 μL Primer 16E2, 1 μL MilliQ, dan 10 μL template DNA genomik, dimasukkan ke dalam mesin PCR dan diatur tahap-tahap PCR yaitu denaturasi 94 ^oC, 20 detik; primer annealing 56 ^oC, 20 detik; primer extension 72 ^oC, 30 detik; sebanyak 35 siklus; dan tahap terakhir adalah Final extension 72 ^oC selama 10 menit.

Analisis Hasil PCR dengan Elektroforesis Gel Agarosa. Sebanyak 5 μl hasil amplifikasi DNA dengan PCR dicampur dengan gel loading solution dengan perbandingan 1 : 1 dan dianalisis dengan gel elektroforesis yang mengandung 2% agarose dalam 1 × TAE buffer (10×TAE; 40 mmol l^-1 Tris-asetat pH 7,6 dan 10 mmol l^-1 Na₂EDTA) dan etidium bromida. Cuplikan yang berupa sampel, kontrol positif dan DNA penanda dimasukkan dalam sumur-sumur gel dan dialirkan arus listrik 50V hingga warna indicator mencapai 1 cm dari tepi bawah gel. Setelah itu gel diamati pita-pita DNA-nya menggunakan UV transilluminator. Foto gel dilakukan dengan kamera digital dalam suatu cungkup yang dihubungkan ke komputer. Fragmen yang terlihat dibandingkan dengan kontrol positif dan DNA penanda. sampel menunjukkan positif mengandung Escherichia coli jika terdapat pita nyata pada ukuran 584 pasang basa pada elektroforesis gel.

Deteksi Escherichia coli secara Konvensional menggunakan Media Perbenihan. Dipipet 25,0 mL sampel ke dalam labu takar yang telah diisi dengan 225 mL larutan Buffered Pepton Water, dikocok dan dihomogenkan sehingga didapat pengenceran 1 : 10. Kemudian dilakukan pengenceran bertingkat sehingga didapat seri pengenceran 1 : 100 dan 1 : 1000. Sebanyak 1,0 mL larutan dari pengenceran 10^-1 dipipet dan dimasukkan dalam masing-masing tiga tabung yang berisi Lactose Broth yang di dalamnya terdapat tabung Durham terbalik. Cara yang sama juga dilakukan terhadap pengenceran 10^-2 dan pengenceran 10^-3 kemudian diinkubasi pada suhu 37 ^oC selama 24-48 jam. Setelah 24 jam, pembentukan gas dalam tabung Durham diamati. Bila belum terbentuk gas, maka diinkubasikan lagi selama 24 jam. Sebanyak satu sengkelit (ose) dari tiap tabung yang membentuk gas pada media Lactose Broth dipindahkan ke dalam tabung yang berisi 10 ml Brilliant Green Lactose Bile Broth 2% (BGLB) yang di dalamnya terdapat tabung Durham terbalik kemudian diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 37^oC. Escherichia coli dianggap positif jika di dalam tabung terdapat gas. Uji konfirmasi bakteri Escherichia coli dilakukan secara biokimia dengan menginokulasikan biakan dalam BGLB yang positif kedalam media selektif yaitu media Eosin Methylene Blue (EMB) dan beberapa uji reaksi fermentasi yaitu uji indol, methylred, Voges Proskauer dan uji sitrat.

Hasil PCR positif Escherichia coli ditunjukkan dengan adanya fragmen DNA pada ukuran sekitar 584 pasang basa, pada gel elektroforesis. Dalam penelitian ini juga dilakukan uji konfirmasi hasil PCR menggunakan metode konvensional dengan kultur. Sebanyak empat dari sepuluh sampel air mengandung Escherichia coli baik yang diidentifikasi dengan metode konvensional maupun dengan metode PCR. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode PCR dapat mendeteksi Escherichia coli secara spesifik dan lebih cepat daripada metode konvensional.